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模式动物器官透明化高分辨率3D成像

来源:网络 更新时间:2018-12-12

 显微成像是其中重要且基础的研究工具,但是许多已有器官水平研究大多集中在2D成像上,如利用经典的组织切片方法,采集大量的2D图像进行观察。既耗费时间,同时又不能很好地说明器官的整体结构和状态。

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▲图1. 斑马鱼睾丸器官3D荧光成像。
Maxence Frétaud等研究成果。

近两年,对整个器官的三维成像以理解其结构同时进行细胞计数及表达定量分析已经成为研究热点(图1),也是新挑战。透明化方法因在生物大样品成像中发挥关键作用而日益受到科学家关注。目前,已有多种方法来增强样品透明度以进行大生物样品整体成像。

今天和大家一起去看看法国国家农业研究所(INRA,欧洲最大、世界第二大农业科学研究中心,http://institut.inra.fr/en)的科学家于2017年在《Scientific Reports》上发表的《透明化斑马鱼整个器官高分辨率3D成像》论文中透明化后大样本成像结果。

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该研究详细地对比分析了5种常见透明化方法(RIMS, SeeDB, 3DISCO, CUBIC和PACT)对斑马鱼睾丸透明化的效率,发现:CUBIC和PACT两种方法在透明度、光学通过效率、荧光信号的干扰和组织结构变形上具有良好表现,最后,成功使用Leica SP8共聚焦双光子双模显微镜对整个斑马鱼睾丸进行了整个器官高分辨率3D成像。

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SP8双光子显微镜对CUBIC方法透明化整个斑马鱼睾丸的3D成像。Volume:5787μm × 2494μm × 703μm。Maxence Frétaud等研究成果。

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SP8双光子显微镜对PACT方法透明化整个斑马鱼睾丸的3D成像。Volume:2749μm × 2316μm × 565μm。Maxence Frétaud等研究成果。

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SP8双光子显微镜对PACT方法透明化斑马鱼睾丸中两条相近生精小管中的两个壁龛结构进行高倍3D重建,发现每个结构内含6个精原细胞(核)。Maxence Frétaud等研究成果。

光子型显微镜使用高能量的近红外光实现对深组织区域的穿透力,而组织内部的折射率不均一,也会导致成像时结构扭曲,荧光亮度大幅下降。因此,对显微镜关键光学部件——物镜的要求很高。

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▲图2. 徕卡motCORR物镜(左),可通过外部旋钮(右上图)和LAS X成像软件(右下图)进行物镜校正环全电动调节。

 

 

近些年,徕卡推出了人性化的motCORR物镜,可通过外部旋钮和LAS X成像软件(图2)即可对物镜校正环进行全电动调节,达到对样品折射率的随时校正,以获得亮度和对比度更高的组织深部荧光图像,以及达到更大的穿透深度。此外,motCORR物镜还可与高数值孔径的水镜、水镜自动加水微泵和AFC(adaptive focus control)自适应稳焦系统全面兼容,轻松实现完美活细胞成像。

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徕卡深度成像专用物镜:

> FLUOTAR L 16x/0.8 IMM motCORR VISIR,FWD 8mm,ne~1.33 – 1.46,0~0.17 mm 盖玻片(适用于活体和透明化样品)

> FLUOTAR L 16x/0.6 IMM CORR VISIR,FWD 2.5 mm,ne~1.33 – 1.52,0~0.17 mm 盖玻片(适用于活体和透明化样品)

> HCX APO L 20x/0.95 IMM,FWD 1.95 mm,ne~1.563(如BABB)

> HC FLUOTAR L 25x/1.00 IMM motCORR VISIR,FWD 6 mm,ne~1.457(如CLARITY)