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大咖讲堂 | 相干拉曼散射显微术 Ⅱ

来源:网络 更新时间:2019-12-18

  

上节我们讲到——相干拉曼散射(CRS)显微术是一种基于分子化学键振动的成像手段。相比于荧光光谱,拉曼光谱具有窄得多的谱峰宽度(图 1),可以选择探测的分子种类将更多,特异性也更高。例如,生物组织中的蛋白、脂质和核酸等具有各自的拉曼光谱特征,利用 CRS 可以在无需染色/标记的前提下对它们进行区分成像。

 

但脱离应用的理论就像浩渺星海中失去坐标的飞船,空得一身高强本领却无处发挥。因此,秉承上节所述的相干拉曼显微术的基本原理,本小节将围绕快速病理检测、生物代谢和药物运输三个典型方面详细展开免标记相干拉曼显微术的应用,为这艘“神州飞船”的前行指引明灯。

2013 年,季敏标教授在哈佛大学谢晓亮教授课题组学习期间利用 SRS 显微镜实现了在脑胶质瘤小鼠模型活体中原位实时地探测肿瘤边界[1],之后在离体人脑肿瘤手术标本中实现无标记病理诊断[2]。归国后,季教授课题组在复旦大学搭建了结合了 SRS、SHG 和 TPEF 的多模态非线性光学成像系统,可同时获取脂质、蛋白、胶原纤维三个通道的图像。在近期一篇文章中,季教授不仅在喉癌组织切片层面展示了 SRS 和传统病理 HE 染色的高度一致性(图 2),并且通过对喉癌术中新鲜组织的成像,累计了数万份图像数据,最后基于搭建的 34 层残差卷积神经网络(ResNet34)进行图像训练识别,获得了近乎 100%准确率的肿瘤与正常组织的鉴别效果[3] 

 

 

由于 SRS 继承了自发拉曼的光谱特性,使其能够在高光谱扫描时得到重要的谱学信息。在对阿尔兹海默(AD)研究的过程中[4] ,发现错误折叠的淀粉样蛋白会因为 β-sheet 的富集而导致 amide I 的拉曼峰蓝移(峰位从 1658 cm-1变为 1670 cm-1);并且通过对新鲜 AD 鼠脑组织成像,观察到了每个 Aβ 斑块的周围都会有一圈“Halo”的特殊构象(图 3),这是荧光研究(只能对确定物质进行特异性染色)所难以发现的,充分体现了 SRS 在病理学检测上的独特优

2018 年,哥伦比亚大学闵玮教授课题组发展了将重水(D2O)代谢与受激拉曼散射(DO-SRS)显微技术相结合的技术,用于原位代谢观测[5] 。在生物代谢过程中,经过酶的催化合成,D2O 中的氘原子会被自动整合到有机分子中,形成同位素标记的 C-D 键。因此,基于对新合成有机分子中 C-D 键的成像,就可以实现生物代谢的追踪观测(视频 1)。目前,在 C-D 键的广泛振动光谱中,他们发现了脂质和蛋白质的特异性拉曼位移,并开发了光谱解调方法来获得具有大分子选择性的 C-D 信号,做到了在动物模型中脂质、蛋白甚至糖类的代谢测量[6][7]

 

2014 年,闵玮教授将疗霉舒乳膏涂抹于小鼠耳朵部位,通过对药膏中盐酸特比萘芬分子的炔基进行特异性成像,结合脂质和蛋白通道的共定位,发现了该药物是通过皮肤中脂质进行渗透的[8](图 5)。

 

同年,谢晓亮教授课题组报道了利用高光谱受激拉曼散射(hsSRS)成像技术对两种酪氨酸激酶抑制剂(TKI)药物(伊马替尼和尼洛替尼)在活细胞内的免标记成像以及定量分析[9] 。他们发现,由于这两种药物具有溶酶体的亲溶性,它们在溶酶体中的浓度都增加了 1000 倍以上。当同时使用氯喹时,伊马替尼的溶酶体捕获减少了十倍以上,这表明氯喹除了常见的自噬抑制机制外,还可能通过溶酶体介导的药物相互作用提高 TKIs 的疗效。

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下一节我们还将聚焦 CRS 发展前沿,介绍 CRS 技术的最新进展。

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