荧光激发和发射的基本原理

荧光染料是光敏化合物，能够吸收特定波长的光能，并转化为波长更长的光。因此，荧光染料是细胞和组织研究中常用的检测试剂。荧光染料特有的电子构型让其具有独特的特征性吸收光谱（常与激发类似）和发射光谱。这些吸收和发射光谱显示了荧光的相对强度，通常纵坐标为相对强度，横坐标为波长。对于已知的荧光染料，制造商会告知光源激发强度峰值的波长，以及荧光发射强度峰值的波长。对于这些荧光染料的激发和发射光谱图与曲线来说，了解其来源很重要。

如何确定荧光染料的发射光谱

确定特定荧光染料的发射光谱时，需要确定最大吸收波长（常等同于最大激发波长）并在该波长下激发该荧光染料。图1(a)中显示了一个典型荧光染料的吸收光谱，纵坐标为吸收的相对强度，横坐标为波长。然后，我们用一个单色器（一种仅允许窄光波段通过的装置）进行扫描，得到全范围发射波长下相对应的荧光发射强度值。图1(b)中显示了基于各波长下荧光相对强度的测量值绘制的发射光谱。确定特定荧光染料的激发光谱时，也采用了类似的方法，即在用一组连续的波长激发荧光基团的同时，监测不同波长下的最大荧光发射强度。确定最大荧光发射强度，并只允许最大荧光发射强度对应波长的发射光通过检测器。在各激发波长下（通常通过单色器）诱导激发，并测量作为波长函数的发射荧光强度。测量结果可绘制为如图1(a)所示的图形或曲线，描绘了全范围激发波长光谱相对应的荧光强度。

激发和发射光谱的观察结果

一组典型的激发和发射曲线或光谱可让我们得到多个观察结果。激发光谱的长波长端和发射光谱的短波长端之间通常会有一个重叠区域。在荧光显微镜中，激发和发射强度与波长的重叠区域（如图1(c)所示）必须通过选择适当的激发滤光片、分光镜（反射光荧光）和发射滤光片来消除。否则，激发光太亮会掩盖较弱的荧光发射光，从而显著降低标本的对比度。

斯托克斯定律

当电子从激发态进入基态时，会有振动能损失（这一现象的解释见“荧光的分子机理”）。因为波长与辐射能成反比()，能量损失使发射光谱较相应的激发光谱更长。这种现象被称为斯托克斯定律(Stokes’ Law)或斯托克斯位移，由George G. Stokes爵士在十九世纪中期发现。斯托克斯位移越大，就越容易分离激发光和发射光。为了获得最高的荧光强度，最好在荧光染料激发波长的峰值处进行激发，在发射波长的峰值处（或由观察者选择的其他波长下）进行检测。激发波长和发射波长的选择由合适的滤光片控制，从而可限制允许通过的波长。在确定整个光学系统的光谱效果时，要求进行额外的技术校正，需要考虑诸如玻璃的透射率和检测器的灵敏度对应不同波长的差异等因素。

图2显示了一个典型荧光染料的吸收-发射光谱图。请注意，这一典型荧光染料的吸收（常与纯化合物的激发曲线相似）和发射荧光强度曲线在形状上有些相似。此外，在激发曲线的长波长端和发射曲线的短波长端有部分重叠。

激发和发射波长的分离

激发和发射波长的分离可通过选择适当的滤光片阻止或放行光谱中的特定波长而实现，如图3所示。荧光照明器的设计是基于对激发光和发射光的控制，即在通向样本的（激发）光路和样本所产生的（发射）光路中插入可随时更换的滤光片。考虑到发射强度低的情况，选择的激发光源必须有足够的亮度，这样才能最大限度地检测到相对较弱的发射光，同时选择的荧光染料需要具备合适的吸收和发射效率。

荧光染料吸收激发光的效率称为分子消光系数。分子消光系数越大，给定波长范围内光吸收的可能性就越大（诱发荧光发射的前提条件之一）。发射光的产率称为量子产率，即发射的量子数（能量“包”）与吸收的量子数之比（许多商用荧光染料的产率在0.1和0.9之间）。量子产率低于1是能量通过非辐射路径（如热或者光化学反应），而不是通过荧光的再辐射路径损失能量的结果。表1中给出了一组特定荧光染料的荧光量子产率。请注意，有些荧光染料的量子产率似乎很低（苯），而其他则很高（荧光素和罗丹明-B）。

荧光染料的荧光量子产率

表1

光源的分子消光系数、量子产率和平均发光强度（固有亮度）以及荧光寿命（激发态的持续时间）都是影响荧光发射强度和可用性的重要因素。此外，荧光染料周围的局部环境是决定荧光发射特性的关键因素。环境中的溶剂粘度、离子浓度、pH值和疏水性等变量，对荧光强度和激发态的寿命都有着重要影响。

荧光的分子机理

另一种描绘荧光活性的方法是雅布隆斯基(Jablonski)图，如图4(a)所示。激发前，分子的电子构型通常处于基态下。吸收了激发光的一个光子后，电子可能在短短的几飞秒（10^-15秒）内获得更高的能量跃迁到振动激发态。

在大约万亿分之一秒（皮秒或10^-12秒）内，激发态电子可能会向周围环境中释放部分振动能，并返回到最低激发单重态。随后，电子可从最低激发单重态“弛豫”回到基态，同时发射荧光，如图4(a)所示。发射光的波长始终比激发光波长长（斯托克斯定律），而且只要激发光一直照射荧光标本，发射光就会持续存在。如果激发光停止，发射荧光也会消失。

有时，激发后的电子不会在振动效应下弛豫到最低的单重态，而是向激发三重态进行跃迁，然后再回到基态，在这个过程中，辐射的发射现象可明显延迟几秒或更多时间。这一现象是磷光的特征，如图4(b)所示。在某些情况下，激发后的电子可能会从三重态回到最低的激发单重态，然后再回到基态，随后发射荧光。这一作用的时间比通常的荧光略长（约一两微秒），称为延迟荧光（图4(c)）。在光漂白或存在重金属盐或其他化学物质等其他情况下，发射光可明显降低甚至完全消失。

褪色或光漂白

有些特定条件可影响受激发的荧光基团的再辐射，从而导致荧光强度下降。这种降低发射光强度的现象通常称为褪色或光漂白。有时会将褪色进一步细分为淬灭和漂白。漂白是荧光分子在分子氧存在下由于光强而发生的不可逆分解。淬灭也会导致荧光强度降低，且常由氧化剂的作用或存在重金属盐或卤素化合物而导致。

通常，淬灭是由于能量从激发态荧光基团转移到物理上接近的其他受体分子而形成的，也称为共振能量转移。这种特殊的现象已经成为一种更新技术的基础，这种技术用于测量远低于光学显微镜横向分辨率的距离。

漂白的发生导致了FRAP技术的形成，即荧光漂白后恢复技术。FRAP技术利用短脉冲激光漂白，从而可观察随后因荧光基团扩散到漂白区域中而引起的荧光恢复现象。

常用抗淬灭试剂的特性

表2

为了降低部分样本的褪色程度，建议在光到达激发滤光片之前的光路中使用一个中性灰度滤光片，可以降低激发光的强度。在其他情况下，可改变封片剂的pH值或使用抗漂白剂（表2中列出了几种较为重要的试剂）可减轻褪色效应。在数字成像、显微成像或简单目视观察时，快速改变观察视野也可避免褪色效应。

什么是数字成像？

数字成像是一个用于描述图像的电子记录的广义术语。您几乎可以用数字方式捕捉任何图像——从日落风景到显微镜标本，再到扫描文档。

什么是数字图像？

数字图像是由一系列像素或图片元素组成。通过计算机读取图像文件并显示像素就可以在显示器上显示图像。

数字成像有何优点？

显微镜数字成像的四个核心优点：

• 永久记录：您可以在不降低图像质量的情况下无限复制同一幅数字图像。所以数字成像可帮助您保存科研载玻片并避免样品降解问题。

• 图像共享：数字图像可以通过电子方式发送给远方的同事，帮助您节约邮寄协作项目载玻片的运输费用。

• 图像调整：使用像cellSens成像软件这类用于显微镜的图像采集处理程序，您只需点击几下即可轻松处理原始数字图像，解决对比度不佳和噪点过多等问题。

• 定量分析：数字成像可以为定量图像分析提供数据，帮助您获得新的信息。比如说，您可以将数据与数据库中以前的成像结果进行比较。

如何提高显微镜的数字成像质量？

为了提高显微镜图像的质量，就要选择匹配您应用的光学器件和相机。

我们提供的在线资源可以帮助您找到供实验使用的显微镜物镜和相机。本博客就是一个很好的起点。更多指导信息，请参考我们的博客文章：如何选择合适的显微镜物镜：10个问题和选择合适显微镜相机的4种工具。

哪个显微数码相机功能参数最为重要？

影响图像质量的因素有很多。通常来说，可以先从相机分辨率和灵敏度开始。灵敏度是指相机传感器检测来自样品光线的能力。分辨率是指相机可捕获的细节程度。但正如我们之前提到的，这些功能必须要与您的光学器件、系统和应用保持一致。

举个例子：高分辨率的相机与低数值孔径的物镜并不搭配，因为其无法恢复经光学元件损失的样品结构信息。原因在于光分布的距离超过了相机的像素间距。在这种情况下，较低分辨率的相机将更适配较低数值孔径的物镜。

再比如，您需要在700~900nm波长范围内观察。那么选择能够感知该波长范围的相机非常重要。

另外还有许多其他因素需要考虑，因此请务必阅读我们的白皮书：选择显微镜相机时应当考虑的因素。

我们应该选择哪种类型的显微镜相机传感器？

几种类型的相机传感器各有优缺点：

• CCD是电荷耦合器件的首字母缩写。简而言之，CCD是具有光敏区域并作为数码相机传感器使用的半导体芯片。CCD传感器捕获光子并将其转换为电荷，而电荷则是用于成像的数字像素数据。传统上看，CCD传感器是科学研究应用的最佳选择。但是随着新传感器技术的出现，这种较为老旧的技术正逐渐风光不再。

• EMCCD代表电子倍增电荷耦合器件。EMCCD是一种可以将高于CCD读取噪声的弱光信号放大的CCD传感器。在传统CCD中，极低的信号水平通常低于传感器的读取噪声，因此其成像能力在以快速帧率捕捉极低光照水平下图像的应用中受到限制。
  EMCCD相机以检测弱光而著称，所以您可能有时候听见有人将其称为弱光相机。由于具有较高灵敏度，它因此成为在极弱光线下捕捉快速生物现象的有效工具。

• CMOS即互补金属氧化物半导体，也是CCD技术的后继产品。CMOS和CCD之间的首要区别是信号电子的读取架构。
  由于为单光敏二极管提供多读出放大器，CMOS的读取速度明显快于CCD。快速读取的弊端在于卷帘快门失真。由于CMOS快速扫描整个图像以收集数据，而非每次捕捉一个像素，因此曝光时间差有时会导致失真。
  相比之下，CCD传感器可以通过在存储电荷同时收集入射光子避免这种失真，从而让其能够同时读出每个像素。
  传统上，CMOS的信噪比低于CCD，但现在已经推出很多高质量的CMOS相机。另外，全局快门CMOS的引入解决了卷帘快门失真问题。

• sCMOS是科研级互补金属氧化物半导体的缩写，通常也缩写为科研级CMOS。 sCMOS是一种具有大尺寸像素和低噪声性能的CMOS传感器。其具备比常规CMOS更高的灵敏度。通常我们会像冷却CCD传感器一样，通过对sCMOS进行冷却来最大限度减少暗电流，以此获得更高的信噪比。
  sCMOS和EMCCD相机之间最重要的区别是sCMOS相机不具备长时间曝光的能力。对于需要长时间曝光或具有弱荧光信号的生物发光成像应用，EMCCD相机是首选，而sCMOS相机由于其能够与多种成像技术配合使用而广受欢迎。

来源于：蔡司官网

用于食品分析的显微镜解决方案 (zeiss.com)

光学显微镜：单目、双目、三目之间的区别

关于徕卡单目显微镜、徕卡双目显微镜、徕卡三目显微镜之间的区别主要是目镜的个数不同。

单目显微镜只有一个目镜，只能用一个眼睛进行观察，是单光路通道。双目显微镜有两个目镜，可以双眼同时观察，是双通道光路。三目显微镜除了可用双眼来观察两目外，还有一目是用来外接电脑和数码相机的。可以通过外接电脑或者数码相机对物体进行观察、记录。

市面上常见的是双目显微镜和三目显微镜。三目显微镜又是双目显微镜的延伸、扩展。三目显微镜在内部设计分光棱镜或者多组棱镜配置的时候，可将显微镜光线通过设计分别输出双目和第三目。三目显微镜在于能达到显微镜链接电脑或者相机进行拍照，图像处理，遥控显微镜操作等功能。

有助呈现生物样本的未染色透明结构

相差是一种光学显微镜技术，用于增加未染色样本的对比度。未染色样本的结构，例如活细胞或其细胞器，在明场照明下观察时可能显得模糊，甚至变得透明。若使用相差显微镜观察相同的样本和结构，就能以更高的对比度和更丰富的细节，清楚呈现这些样本和结构。

利用相移进行成像

由于人眼或光电传感器仅能观察到光波振幅（即强度）或波长（即颜色）的变化，因此对样本进行染色可以诱导振幅变化，导致光线穿过样本后在强度和/或颜色上出现差异^[1]。会引起光波振幅变化的样本或其结构称为振幅物体^[1]。染色剂非常有用，因为它们可以针对样本中的特定结构染色，不过它们可能导致活细胞中毒。

相差显微镜能够利用光路长度差异引起相移，从而视觉呈现原本难以观察到的模糊样本结构^[1]。它借助新形成光波的干涉将相移转化为振幅偏移。在光线穿过时会引起相移的样本或其结构称为相位物体^[1]。

相差显微镜技术诞生于1930年代，由荷兰物理学家弗里茨·泽尼克发明^[1-3]。1942年，这种技术投入实际应用，而泽尼克本人也于1953年获得诺贝尔物理奖^[4]。

图1：利用相差技术和明场照明拍摄到的犬肾细胞（MDCK）图像。

图2：利用相差技术和明场照明拍摄到的单细胞生物变形虫变形杆菌图像

光波干涉

光路长度（OPL）是介质的折射率（n）与光线在介质中两点之间传播距离（d）的乘积。OPL = nd。光路可能需要光线穿过多种介质，例如气体、液体或固体。常见示例包括光线从空气进入水中，或者从空气进入玻璃。光路长度与光线的传输时间和速度有关。光路长度的差异导致光波穿过样本的速度不同，即相移。因此，相位存在差异。与周围介质相比，较高的折射率会导致光波减速并降低相位。

干涉描述了两道光波之间的相互作用，并按照叠加原则形成新的波形。光波干涉的相关参数是它们的振幅。如果两道波相互干涉，生成光波的振幅等于每个干涉光波振幅的矢量和。

如果形成光波的振幅增大，这种干涉可以描述为相长干涉（构造性）。只要两者的波峰和波谷在同一个时间点相遇，就会出现这种情况。也有可能，一道光波的波峰与另一道的波谷在同一个时间点相遇。这种情况会导致形成振幅较低的光波。这两道光波之间的干涉称为相消干涉（破坏性）。

相差显微镜中的光路

相关显微镜的关键元件是环形光圈和相位板。环形光圈位于聚光镜的前焦平面内，限制了光波穿透的角度。相位板位于物镜的后焦平面内，搭配相差环，其材料可以按照λ/4的幅度调暗穿过相位板的光线，其中λ代表光线的波长。

在采用科勒照明的相差显微镜^[5]中，不与样本相互作用的光波在物镜的后焦平面上聚焦为明亮的光环。光环沿光轴方向上与相差环形成空间匹配，引发未偏离光的相移。样本衍射产生的光线并不完全照射在相差环上，因此不受影响。

受影响和未受影响的光波之间，最高可以形成λ/2的总相移。未偏斜光的相位在相差环处会提前λ/4，穿过生物样本时的衍射或散射光波通常会延后λ/4。λ/2的总相移会令光波在图像平面内产生相消干涉。为了增强对比度，未偏斜光在穿过相差环时会变暗并且有一部分光线会被相差环吸收。一定要避免未偏斜光比偏斜光更加明亮的情况，因为那会降低对比度。

相差显微镜中观察到的λ/2相移会产生最大程度的相消干涉效应，因为光波的波峰和波谷在同一时间点重合。因此，生成光波的振幅会减少，相位物体的相移转换为振幅偏移。

图3：相差显微镜中的光路穿过聚光镜环的环形光线通过聚光镜聚焦在样本上。部分环形光线被样本的光学致密结构（例如细胞膜、细胞器等）衍射，出现大约¼λ（通常适用于生物样本）的相移。这种相移和衍射光会绕过相差环，因此几乎不受相差环（通常位于物镜的后焦平面内）的影响。相反，来自聚光镜环的直射环形光线会直接到达相差环，后者会调暗直射光并引起相移（通常提前¼λ或延迟¾λ，以获得正相差）。由于样本折射光线与穿过相差环的光线之间存在高达½λ的总相移，因此会产生相消干涉。所以，光学致密结构会显得更暗（正相差）

图4：相差环是相差显微镜的核心部件。通常它由灰色滤光片和保留板组成。穿过样本且未发生衍射的光线部分穿过相差环（左箭头）灰色滤光片会让光线变暗以避免辐射。保留板会延迟非衍射光的相位，以便与穿过样本时发生衍射并经历相移的光波形成干涉（右箭头）

正相差和负相差——两种形式的相差

相差分为两种形式：正相差和负相差两者的主要区别在于使用的相位板。对于正相差，穿过相差环的光线相比偏斜光会增加，对于负相差，相位会减少。负相差中的相位延迟会产生相位差异，导致光波受到破坏。光波存在相位，并引发相长干涉，而非相消干涉，导致生成的光波振幅增加。

在正相差显微镜中，折射率高于周围介质的对象比折射率较低的对象显得更暗。在负相差显微镜中，情况完全相反。

解读相差图像

相差显微镜可以视觉呈现光线穿过样本时的光路长度差异。光路长度与样本的厚度和折射率有关。细胞膜和细胞器等细胞结构对于光路长度具有深远的影响。由于许多细胞（特别是细胞培养液中）具有扁平且规则的形状，因此使用明场显微镜几乎无法看到它们。

这种细胞相差图像可以放大细胞结构的差异，可以视为光致密图，因为光密度对于样本或样品的折射率有很大影响。不过，多种效应会导致相差图像的正确解释变得复杂，因为它们不直接取决于光路长度的差异。

光晕效应可以描述大型相位物体周边出现的正相差亮边或负相差暗边。光晕会形成是因为来自样本的部分衍射光会穿过相差环。未偏振波形成的光环要比相差环小一点，因此来自样本的低空衍射光波可以穿过相差环。穿过相差环的偏斜光保持着90°的相差，因此不受干涉的影响。这会导致对比度反转，导致大型物体的边缘出现光晕。

遮光效应是指样本的均匀部分和周围介质一样，以相同的光强度来显示所发生的情况虽然穿过这些区域的光线会发生相移，但只有轻微的衍射，且散射角度大幅降低。因此，这些光波进入相差环时，就像未偏斜光一样，不会发生干涉。

相差显微镜的另一个问题就是可能发生对比度反转。如果折射率很高的物体旁边是折射率较低的物体，它们就会显得更加明亮，而不是更暗（正相差的原因）。在这些区域，相移不是生物样本常见的λ/4，因此会出现相长干涉，而不是相消干涉（这与负相差正好相反）。

虽然这些效应会让相差图像在解读时更加困难，但相差显微镜是一种简单且重要的光学对比成像技术，可以对相位物体成像。此外，相差显微镜能够研究活体样本中的细胞功能和结构，因此是生物学研究中最为常用的光学对比法。

图5：曲霉菌的相差图像

图6：大鼠睾丸的相差图像

参考文献：（上下滑动查看更多）

1.E. Hecht, Optics, 5 Ed., Ch. 13 Modern Optics: Lasers and Other Topics, Sec. 13.2.4 Phase Contrast (Pearson, 2017), ISBN13: 9781292096933. www.pearson.ch/HigherEducation/PhysicsAstronomy/AdvancedPhysicsOptics/EAN/9781292096933/Optics-Global-Edition

2.F. Zernike, Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects, Physica (1942) vol. 9, iss. 7, pp. 686-698, DOI: 10.1016/S0031-8914(42)80035-3.X. www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S003189144280035X

F. Zernike, Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects part II, Physica (1942) vol. 9, iss. 7, pp. 686-698, IN1, 981-982, IN3, 983-986, DOI: 10.1016/S0031-8914(42)80079-8. www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0031891442800798

4.F. Zernike, Nobel Lecture, Nobel Prize in Physics 1953, Nobel Prize Organization (2023). www.nobelprize.org/uploads/2018/06/zernike-lecture.pdf

5.M. Wilson, Koehler Illumination: A Brief History and a Practical Set Up in F

来源于徕卡显微系统微信公众号

https://mp.weixin.qq.com/s/SwICZf-aFWcI9TsOdpE3mw

SO 16232标准和VDA 19指南对汽车行业制造过程的重要性

本文讨论了ISO 16232标准和VDA 19指南，并简要总结了颗粒物分析方法。它们为汽车零部件在微粒污染方面的清洁度提供了重要标准。此类颗粒物会对产品性能和寿命产生影响。在清洁度分析中，可以使用自动光学显微镜方法来确定颗粒物类型、大小和造成损坏的可能性。有时，需要更多成分信息，才能准确找到潜在的损害和污染源。这时候就需要借助激光光谱（LIBS）或电子显微镜。

标准化方法可以帮助零部件供应商和产品制造商获得可再现、可靠和可比较的清洁度。汽车和运输行业的主要标准是ISO 16232[1]和VDA 19[2,3]。供应商和制造商在清洁度分析中需要参考标准中常见参数的定义和值范围，例如颗粒物尺寸和成分、颗粒物识别的阈值、图像设置等。汽车行业中用于清洁度分析的颗粒物检测和计数通常符合ISO标准和VDA指南。本文简要概述了ISO 16232和VDA 19中提到的颗粒物分析方法。

对于汽车行业，ISO 16232标准定义了用于确定污染物颗粒大小和数量的方法[1]。从汽车零部件中提取这些颗粒物时，使用液体清洗，并用膜过滤器过滤液体，随后收集表面上的颗粒物。然后使用光学显微镜（手动或使用自动系统）和图像分析技术分析颗粒物[4-6]。最后便可获得粒径分布。
VDA 19指南补充了ISO 16232标准[2,3]。VDA 19更详细地说明：适用范围和有效性、清洁度检查、监测变化、检查方法的选择、测试组件的适当清洁处理、提取程序设置、验证、以及空白测试以及案例研究[2]。此处仅提及VDA 19.1和技术清洁度检查。

通常使用光学系统对滤膜进行全自动分析来验证清洁度。颗粒物检测、测量和分类很大程度上取决于镜头（即放大率和分辨率）、照明类型（例如偏振、明场或暗场）、图像处理软件中使用的阈值以及颗粒物特性（尺寸、成分、反射率等）。因此，在比较相同类型颗粒的结果时，光学系统和分析参数必须相同。
标准光学分析
为了提供有意义的比较，建议进行标准光学分析。标准光学分析中，在确定规范之前定义图像设置和分析过程，因此与使用的系统无关。
颗粒物的检测和测量
测量的精度主要由显微镜镜头的放大倍率和分辨率决定。更高的放大倍率可以提高精度，但也会降低景深。因此，当在高放大倍率下测量小颗粒时，垂直方向的电动平台系统可以补偿低景深和过滤器表面的不规则性。使用高放大倍率还需要分析大量图像，以便全面检查滤光片。因此，必须在测量精度和处理/分析时间之间找到平衡点。
此外，为了准确地确定尺寸和范围，颗粒应均匀分布在过滤器表面上而没有重叠，并以颗粒物所占的表面百分比来报告。
偏光片
交叉偏振器可用于消除金属颗粒的反射，在这种情况下，金属颗粒在明亮的背景上会显得很暗。如果不使用偏光片，当亮区的亮度与背景滤光片的亮度相似时，就有可能将亮区和暗区的颗粒分成几个颗粒。不使用偏光片时，非常接近的颗粒也可能会出现大小和形状的变形，因为当它们靠近在一起时，相邻的颗粒可能看起来很相似，类似于一个更大的颗粒。
颗粒长度和宽度
颗粒的大小和特征可以通过标准分析来确定。颗粒长度，即2条平行线之间的最大距离，Feretmax，其可以应对于2个敏感元件[5]之间的距离，例如电引线，这意味着颗粒能够“连接”它们。宽度或Feretmin是2条平行线[5,6]之间的最小距离，当它对应的通道宽度足以使颗粒通过时，则表示存在潜在的危险。
纤维
纤维在制造过程中也是一个常见问题，但纺织纤维（例如来自服装的纤维）的潜在破坏性弱于纤维状颗粒物，因此应将这些类型相互区分开来。通常，细长长度与最大内径之比大于20且内径小于50 µm的颗粒会被认为是纤维。
金属颗粒
金属颗粒是组件上最常见的污染物之一，由于其机械和电气特性，它们对许多应用具有高危害性。由于光学外观的变化，基本标准光学方法无法可靠地识别金属颗粒，需要使用扩展分析方法。
然而，可以使用非偏振光学系统进行第一次表征，通过其闪亮外观（直方图强度值接近白色的强度值的反射）识别金属颗粒。可以执行自动分析以确定闪亮颗粒是否为金属，但只有在系统参数（镜头类型、放大倍率、其他参数设置等）和颗粒特征（颜色、粗糙度、均匀性等）相同时才能比较结果。如果满足以下两个要求，则可以使用此方法：
通过已使用的参数设置确定颗粒具有金属光泽，但可能需要事先进行扩展分析加以证明
由专业的操作员目视确认自动表征结果
材料和设备
颗粒分析需要以下材料和设备：

• 显微镜
  无伪影均匀光源发出的入射（反射）光
  滤光片必须紧紧固定在样品架上，最好用玻璃盖压平，以确保整个滤光片可以在特定放大倍率下成像
  过滤器的定位使用电动装置完成，精确性应可以观察到最小颗粒
  镜头分辨率和相机传感器的像素数应匹配，以便可以应用10 像素标准，即最小颗粒尺寸应对应于至少10个像素（参见图1）

当需要有关形状、成分、来源、物理特性（硬度、磨损性等）或颗粒造成损坏的可能性等额外或更详细信息时，可以使用扩展分析方法。使用扩展分析可以更确定地识别金属颗粒。
颗粒高度
显微镜镜头的景深(T)可用于估计颗粒的高度(H)。T值随着镜头数值孔径(NA)而减小，因此，在更高的放大倍率和分辨率下会减小。使用以下等式计算：T = 550/(NA)2.H值可以根据颗粒顶部和底部的焦平面之间的垂直差或透镜沿Z轴的运动来确定[5,6]。应记录所有测量的颗粒高度，因为这些数据以及宽度和长度可用于确定潜在的损坏。
成分分析
单个颗粒的成分可以通过使用激光诱导击穿光谱（LIBS）或能量色散X射线光谱（EDS/EDX）进行直接元素分析来获得。LIBS中使用激光脉冲撞击颗粒，形成局部等离子体并发射特定波长的光[7]。然后使用光谱数据库来识别颗粒元素成分。使用扫描电子显微镜（SEM）执行EDS。

市场需要这样一种解决方案：它不仅能使用户满足ISO 16232标准和VDA 19.1指南的颗粒分析要求，同时还可以减少耗费的时间和精力。利用清洁度分析解决方案，用户可以根据ISO 16232和VDA 19的当前要求以及未来可能的更新来分析颗粒。
了解颗粒成分有助于可靠地确定颗粒造成损害的可能性并确定污染源[1,2]。使用二合一材料分析解决方案，结合光学显微镜和LIBS[6,7]，可以有效地执行颗粒的成分分析。目视检查过滤器上的颗粒，然后立即使用LIBS[6]进行化学分析，无需将过滤器转移到另一台仪器或开展额外的样品制备

1. ISO/DIS 16232:2018, Road Vehicles - Cleanliness of components and systems, International Organization for Standardization.

2. VDA (German Association of the Automotive Industry), QMC (Quality Management Center), Volume 19, Part 1, Inspection of Technical Cleanliness, Particulate Contamination of Functionally Relevant Automotive Components, 2nd Revised Edition, March 2015.

3. VDA (German Association of the Automotive Industry), QMC (Quality Management Center), Volume 19, Part 2, Technical cleanliness in assembly, Environment, Logistics, Personnel and Assembly Equipment, 1st edition 2010.

4. Y. Holzapfel, J. DeRose, G. Kreck, M. Rochowicz, Cleanliness Analysis in Relation to Particulate Contamination: Microscopy based measurement systems for automated particle analysis, Science Lab (2014) Leica Microsystems.

5. N. Ecke, Basics in Component Cleanliness Analysis, Science Lab (2017) Leica Microsystems.

6. J. DeRose, K. Scheffler, D.R. Barbero, Key Factors for Efficient Cleanliness Analysis, Science Lab (2020) Leica Microsystems.

7. K. Scheffler, See the Structure with Microscopy - Know the Composition with Laser Spectroscopy: Rapid, Complete Materials Analysis with a 2-Methods-In-1 Solution, Science Lab (2018) Leica Microsystems.

汽车工业现在会通过一系列装饰或功能性处理改善车身表面。然而，用于检测多层样本的传统质控方法不仅耗时，而且还会漏检缺陷。结定位表面研磨系统和光学显微镜的新方法有望提高检测的速度和可靠性。

安美特西班牙实验室经理F. Javier Ruiz Balbas讲述了自己使用这一系统的体验。安美特是一家全球领先的供应商，专为印刷电路板、先进包装和半导体制造以及装饰性和功能性表面处理提供特种化学药品、设备、服务和解决方案。

您能简单介绍下质控部门的工作流程吗？

您工作中的主要挑战是什么？

随着新材料的发展，汽车工业中对质控的要求有哪些变化？

您公司的质控部门有哪些独特的优势呢？

在使用徕卡EM TXP/DM2700 M系统之前，工作流程是怎样的？有哪些不足之处？

您在日常工作中已经积累了一些操作徕卡EM TXP/DM2700 M的经验，那么您对它有什么概括性的总结呢？系统的哪些优势对您的质控工作帮助最大？

来源:徕卡显微系统https://mp.weixin.qq.com/s/O4b7hcVhermpLAeux5w-ag